无溶剂体系中的脂肪酶催化反应研究进展

　第20卷第6期　2006年12月

文章编号:1001-3555(2006)06-0597-07

分　　子　　催　　化

JOURNALOFMOLECULARCATALYSIS(CHINA)

Vo.l20,No.6　Dec.　2006　

无溶剂体系中的脂肪酶催化反应研究进展

吴小梅

1,3

,辛嘉英

1,2

,张颖鑫

1,3

,翟宗德

1,3

,夏春谷

(1.中国科学院兰州化学物理研究所羰基合成与选择氧化国家重点实验室甘肃兰州7300002.哈尔滨商业大学生物工程系黑龙江哈尔滨150076;3.中国科学院研究生院北京100039)

关　键　词:无溶剂;酶促反应中图分类号:O643.3

文献标识码:A

　　酶作为一种生物催化剂,具有专一性强、催化效率高、在常温常压等温和条件下能进行操作等优点,从而引起众多学者的兴趣.传统酶学研究的是酶在水溶液中的催化行为,这使得人们产生了误解,认为只有在水溶液中酶才能保持活性,有机溶剂会使酶变性失活.1984年,美国麻省理工工学院的科学家Klibanov首次发现有许多酶可用于有机溶剂,从而解决了有机化合物在水介质中的低溶解性限制酶催化剂应用的问题,酶不仅能够在有机溶剂中保持稳定,而且还显示出很高的催化转酯活力.这一发现为酶学研究和应用带来了又一次革命性飞跃,从而促进了非水酶学的兴起,使之成为目前重要的酶技术之一.其中研究较多的是脂肪酶,脂肪酶不仅能催化油脂水解,而且在非水介质中也能催化油脂的酯交换反应,用来提高油脂的品位

[2,3]

[1]

世纪90年代兴起的绿色化学,力图克服在生产和使用化学物质的过程对环境造成的污染.在有机化学物质的合成过程中(特别是固体物质参与的反应)使用有机溶剂是较为普遍的,这些有机溶剂会散失到环境中造成污染.各国化学家创造并研究了许多取代传统有机溶剂的绿色化学方法,如以超临界流体为介质,以室温离子液体为溶剂等,而最彻底的方法是完全不用溶剂的无溶剂有机合成,发展到酶催化反应中,即为无溶剂酶催化反应体系.

在无溶剂体系中,酶直接作用于反应底物,因此无溶剂体系具有如下优点:1.提高了反应底物浓度和产物浓度;2.反应速度快;3.产物收率高;4.反应体积小;5.减少了产物分离提纯的步骤,使纯化容易;6.因不用或少用有机溶剂而大大降低了对环境的污染,降低了回收有机溶剂的成本;7.为反应提供了与传统溶剂不同的新的分子环境,有可能使反应的选择性﹑转化率得到提高.因此,它是一个极具潜力的清洁反应新技术,并且应当成为选择反应介质时优先加以考虑的方法,值得大力加以研究和提倡.

无溶剂反应体系也有其固有的缺点,特别是对以前使用有机溶剂较为普遍的固体物质参与的反应,可能会有如下问题:(1)反应能否进行︕因为参加反应的分子之间要接近到一个小距离(如<1nm)才可能发生反应,而不同反应物粉末混合时,达到此距离的异种分子对所占的比例很小,因而许

.随着研究的深入和学科的交叉,各种新的

[4,5]

酶促反应体系也相继被发现,大大拓宽了酶催

化反应的应用范围,使酶法合成逐步发展成为与化学法合成相互补充的合成方法.近年来非水介质中的不同反应体系的酶催化反应,主要有:有机溶剂体系、反相胶束体系、超临界体系、气相体系等,其中无溶剂体系中的酶促反应是非水体系中酶促反应的特例.

由于人口增加,生产发展,人类活动加剧,使地球上的生态环境受到的污染日益严重.其中许多问题与人类合成的化学物质的生产和使用有关.20

收稿日期:2005-06-03;修回日期:2005-08-18.

基金项目:国家重点基金项目(20533080),黑龙江省自然科学基金(B200403),

哈尔滨市(2004AFXXJ031)和省教育厅科学基金项目.

作者简介:吴小梅,女,1979年生,硕士研究生.*通讯联系人,E-mail:cgxia@ns.lzb.ac.cn.

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多反应无溶剂下不能进行,要研究采用什么方法促进反应的进行;(2)散热问题,有些反应进行时放热多,在无溶剂条件下就存在散热难的问题;(3)分离问题,反应完成后若得到的是固体混合物,进行分离时,有可能又要使用有机溶剂;(4)因反应系统无流动性,组织大规模的自动化水平高的生产较难.

本文仅初步介绍影响无溶剂体系酶催化反应的主要因素及在无溶剂体系中进行的生物催化反应.

应,加入一定量的辅助剂,可以加快体系中液相的形成,提高反应速度

[8]

.体系中加入的辅助剂主要

[9]

是一些亲水性的含氧有机溶剂,如醇、酮、酯等,它的主要作用是改善体系的性质,而不是反应的溶剂.辅助剂在反应机理中起着复杂的作用,主要是影响体系中液相的组成和理化性质,其次对酶的活性、产物的结晶也有影响,而且它还与反应的产率有关

[8]

.尽管辅助剂的种类和数量随反应和酶的不

1影响无溶剂体系酶促反应的主要因素

1.1水的作用

酶维持活性有赖于其活性构象的维持,而酶的活性构象的形成是依赖于各种氢键、疏水键等非共价相互作用.水参与了氢键的形成,而疏水相互作用也只有在有水参与时才能形成.因此水分子与酶分子的活性构象形成有关.水与酶蛋白分子表面的带电部位和部分极性基因的水合可能是酶催化的先决条件.设想在无水条件下,酶分子的带电基团和极性基团相互作用产生一种非活性的封闭结构,加入的水能使酶分子的柔性增大,并通过非共价作用力来维持其催化的活性结构.所谓无溶剂体系并不是绝对无水,一般指水含量低于0.01%以下,这也是非水反应体系对水的要求,事实上无溶剂体系也

[12][13]

是非水反应体系.KuhlP等和KlibanovAM等认为水是维持蛋白酶催化活性所必须的.KaiedaM

[14]

同而变化,但辅助剂的溶解度参数(δ)值在8.5～10.0之间,㏒P(P表示一种有机溶剂在正辛醇和水两相溶液中的分配系数)在-1.5～-0.5之间为最好.沈树宝等在合成苄氧羰酰-L-天门冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯时,研究了一系列醇类化合物(包括单元醇、二元醇及三元醇)作为助溶剂的作用及变化规律.1.4反应体系的混合方式

液-固体系中的反应体系的混合程度非常重要,特别是对无溶剂体系反应,目前有试管加超声波处理或振荡,搅拌桨式反应器及流化床反应器三种形式.由于搅拌桨式反应器特别适用于高粘度固液混合物的混合,所以设计有搅拌桨的搅拌式反应器应该有更好的工业应用价值.除了上述几个参数外,与其他所有酶促反应一样,温度、pH值及酶浓度等因素也影响此类酶促反应.

[10]

[11]

2无溶剂体系中的酶催化反应

2.1无溶剂体系中的酶催化酯化反应

1990年,Adelhorst等人使用CandidaAntarc-tica固定化脂肪酶在无溶剂条件下,催化1-O-乙基吡喃型葡萄糖苷与羧酸发生有选择性的酰化,反应在70℃下进行,24h后得到了6-O-酰基葡萄糖苷,产率为85%90%,同时产生了少量的副产品2,6-O-二酰基葡萄糖苷.现在这个反应已经可以大规模的应用于生产,底物量达到Kg级.

(17)

　　Isono等人在无溶剂条件下,使用酶-表面活性剂配合物催化油醇和油酸发生酯化反应(见图2).在反应过程中使用了带有微量过滤膜的膜反应器,实验证明,膜反应器在无溶剂反应体系是切实可行的.同时考察了水对反应的影响,发现加入水可以增强表面活性剂包衣酶(LSC)的活性,在加入180mg/g溶液的水时,LSC的活性最好.

[18][18]

　　Torres和Otero使用Novozym435(Candidaantartica)固定化酶,催化乳酸和羟基乙酸与C8C16

[16]

等研究了在无溶剂体系中,水对Rhizopus

oryzae脂肪酶催化植物油与甲醇发生酯交换反应的

影响.当完全没有水时,脂肪酶几乎不发生作用,此时它没有活性;在含有4%30%底物的水量时,脂肪酶可以有效地催化反应.因此,在绝对无水的条件下酶促反应是不可能发生的.对不同的酶及不同的反应底物体系,其水的最佳加入量也是不同的,必须结合具体体系实验摸索研究.

1.2底物比例的影响

底物比例改变会影响反应的速率和平衡.Un-durragaD

(15)

等研究了不同的底物比例情况下的无

溶剂酶促反应.实验中,发现底物配比对达到平衡的时间和平衡后得到的SI值(SI即stearateindex)有很大的影响.在硬脂酸与棕榈油反应中,过量硬脂酸时,SI值增加,棕榈油过量时,SI值减小.1.3辅助剂的作用

在无溶剂体系中,特别是固体物质参与的反

第6期　　　　　　　　　　　　　　　　吴小梅等:无溶剂体系中的脂肪酶催化反应研究进展599

图11-O-乙基吡喃型葡萄糖苷与羧酸的选择性酰化反应[16]

Fig.1theselectiveacylationof1-O-ethylglucopyranosidewithfreecarboxylicacidsintheabsenceofsolvent

(R为n-C7H15,n-C9H19,n-C11H23,n-C13H27,n-C15H31,n-C17H35

)

浓度

图3不同酸醇比时的酯的浓度[19]

Fig.3Effectofacid-/alcoholmolarratioonester

图2酶催化油酸油酯的合成(17)Fig.2

Enzymaticsynthesisofoleyloleate

concentrationforNovozym435

　　国内有关无溶剂体系中酶促反应的研究很少.Xia

[20]

的醇发生酯化反应.通过大量实验发现:30℃时,在乙腈中加入干燥剂及0.28%(w/w)的水,48h后可得到95%乳酸十二酯和24h后得到87%的羟乙酸十二酯;在无溶剂体系中,反应加热到60℃时,可以得到与在乙腈中相同的产率.虽然无溶剂体系反应的温度比原先在乙腈中的提高了很多,但是在60℃时,脂肪酶的活性没有任何的损失,且温度也很容易达到,相比于在乙腈中反应的缺点来说,无溶剂条件下反应要更好.

Guvenc

[19]

等人在无溶剂体系中,使用Novozym435

(Candidaantartica)脂肪酶催化癸酸与甘油的酯化反应.实验中采用了平板骤冷淬灭的方法,研究了反应物的液相状态,发现液相中反应物摩尔比率在一定范围内变化时,表面的摩尔比率没有变化,从而解释了初速率与底物摩尔比率没有明显关系的原因.而且固定化酶周围的癸酸比液相中要多,这就说明了外部的癸酸可能对反应只是一种假抑制作用,这在深入研究中也得到了证实

[22]

[21]

等人研究了无溶剂体系中两种商业

脂肪酶LipozymeRMZM和Novozym435催化乙酸与异戊醇的反应,在30℃下,酸醇摩尔比为1/2,5%的脂肪酶(g/g底物),3.6mol/L乙酸,使用Novozym435反应6h可以得到380g/L的酯,转化率为80%.无溶剂体系中得到的380g/L的酯的浓度,是以前所报道的2.5倍(在转化率相同的情况下).由于乙酸对大多数酶有抑制作用,因此使用乙酸作为酰基受体,在酯交换反应及直接酯化反应中很少能成功的.然而在无溶剂体系中,乙酸的浓度达到3.6mol/L,反应仍能进行.从图3中可以看出,反应在6h达到平衡,且在48h中任何酸醇比的反应都没有水解发生.在无溶剂体系中反应不仅可以使用乙酸为酰基受体而且反应得到了较高的酯