无溶剂体系中脂肪酶催化亚麻油水解反应研究

第33卷第4期　　　　　　　　　　　　　　　　33No.4　　　　　　　　　　　　　　Vo1.2003年8月ChinaSurfactantDetergent&CosmeticsAng.2003

日用化学工业

王英雄,王国富,侯相林,杜俊民,乔欣刚,秦张峰,王建国

(中国科学院山西煤炭化学研究所,山西　太原　030001)

摘要:研究了无溶剂体系中脂肪酶催化的亚麻油水解反应。考察了反应温度、脂肪酶用量、水/亚麻油摩尔比等因素对反应速率及转化率的影响。结果表明,脂肪酶最佳使用温度范围、最大活性温度及完全失活温度分别为:33℃～37℃,35℃,45℃;n(水)∶n(亚麻油)为30∶1;脂肪酶用量以占反应物总质量的5%为宜。研究结果为开发α-亚麻酸的酶法生产工艺提供了基础数据。关键词:油脂;水解;亚麻油;α-亚麻酸;无溶剂体系;脂肪酶

中图分类号:TQ645　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-1803(2003)04-0222-03

　　α-亚麻酸(ALA)是人体维持大脑和神经系统正常运转的必需脂肪酸,1987年就被联合国粮农组织列为人类食物的必需成分。在人体内,α-亚麻酸可通过链延长酶和脱氢酶的双重作用,转化为具有降血压、降血脂、抑制血小板凝聚和减少血栓形成等功效的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。天然α-亚麻酸以甘油三酯(TG)形式和其他脂肪酸共存于亚麻油中,甘油三酯分解为游离脂肪酸(FFA)前,α-亚麻酸很难被人体吸收。关于水解法制备α-亚麻酸的研究,文献[1,2]已报道。夏宗建[1]等利用NaOH溶液先将亚麻油皂化,后用硫酸酸化,得到各种脂肪酸混合物,最后在甲醇液中通过尿素包合,实现了不同脂肪酸的分离,从而得到纯度较高的α-亚麻酸。但该过程存在强酸、强碱使用和有机溶剂残留问题,不符合绿色化学和环境保护要求。

近年来,随着生物催化技术迅速发展,研究人员对生物酶在有机溶剂[3～5]、超临界流体[6,7]中的催化性能做了大量研究工作,对于无溶剂体系中酶催化反应的研究则相对较少[8,9]。但Boulbabaselmi[10～12]指出,酶催化反应的最佳环境是无溶剂体系,因为无溶剂体系既可避免有机溶剂的毒性、易燃及后期分离困难等问题,又可避免超临界流体的高温高压操作;同时,在无溶剂体系中酶可直接作用于底物,提高底物浓度,而且产物分离纯化过程简单、步骤少[13]。

作者通过研究常压无溶剂体系中脂肪酶催化亚麻油的水解反应,考察了反应温度、脂肪酶用量和反应物摩尔比等因素对反应速率和转化率的影响,为开发α-亚麻酸的生产工艺提供基础数据和依据。1　实验材料与方法

1.1　材料

脂肪酶由深圳市绿微康生物工程有限公司提供

(微生物发酵生产,活力为50000U/g,无催化选择性,未固定化,含水5%);亚麻油为超临界二氧化碳萃取所得。经分析测试,各项指标均符合国家标准(GB8235-87),其脂肪酸含量与文献[2]所报道含量的比较列于表1。实验所用化学试剂均为分析纯。

表1　原料中脂肪酸质量分数比较

　　Tab.1　Compositionsoffatacidinthelinseedoil

comparedwithliterature

w(软脂酸)/%w(硬脂酸)/%w(油酸)/%w(亚油酸)/%w(α-亚麻酸)/%

文献值

　　　6.38

4.66

26.3412.2150.51

超临界萃取值

　　　5.42

4.04

25.1416.4448.96

1.2　仪器

离心机800型,上海云楼医用仪器厂生产;电动搅拌器JB50-D型,上海标本模型厂制造;精密天平DT-100A型,北京光学仪器厂制造,精度0.0001g。2　反应与分析2.1　实验方法

将亚麻油与水按一定比例混合,水浴加热到反应所需温度,快速加入定量脂肪酶,同时搅拌记时。为保证反应温度恒定、反应物比例及催化剂相对含量不

变,每次取样时要少量快速。所取样品经离心分离除去水和脂肪酶,取油层测其酸价。2.2　反应方程式

由于油脂水解反应分步进行,反应式可表示为:TG+H2ODG+H2OMG+H2O

+FFAFFA+

OL+FFA

(1)(2)(3)

式中TG为甘油三酯;DG为甘油二酯;MG为甘油单

收稿日期:2002-10-08;修回日期:2003-03-08

基金项目:山西省青年科技研究基金项目(20011013)作者简介:王英雄(1976-),男,硕士研究生。联系人:侯相林,Tel:(0351)4049501,Fax:(0351)4049501,E-mail:houxl@sxicc.ac.cn。

无溶剂体系中脂肪酶催化亚麻油水解反应研究　　　　　　　　研究与开发第4期　　　　　　　王英雄等:

酯;FFA为脂肪酸;GLYCEROL为甘油。当反应开始

且有部分甘油二酯、甘油单酯生成后,上述反应(1)、(2)和(3)同时进行,所以生成物为甘油二酯、甘油单酯、脂肪酸和甘油的混合物。

当完全水解后反应式可表示为:

TG+3H2O2.3　分析方法

水解转化率x(%)的测定按文献[14～17]提供的方法,计算公式如下:

x=AV/SV×100%

式中AV和SV分别为反应过程中亚麻油酸价和皂化价。所用原料经3次测定取其皂化价的平均值,为193mg/g油。3　结果和讨论

3.1　反应物摩尔比

油脂水解是典型的热力学平衡控制反应,物料配比是决定平衡的重要因素。水/亚麻油摩尔比比例过高,导致产物分离困难;过低,反应进行不完全。图1是33℃时m(脂肪酶)/m(总反应物)为5/100、不同水/亚麻油条件下的实验结果。可以看出,在所考察的范围内,随着水/亚麻油比例的增加,转化率一直保持上升趋势。n(水)/n(亚麻油)<20/1时,转化率上升迅速;比例超过20/1后,转化率上升缓慢。上述结果的原因在于:①体系中过量的水推动了平衡右移,转化率上升;②由于油脂水解反应发生在油水界面上,过量的水可促进脂肪酸和甘油分别分散于油相和水相。产物和反应物的分离及生成物在油水界面上浓度的降低同样推动了平衡右移。当水/亚麻油摩尔比超过20/1后,上述两种因素的影响可能接近极限,转化率上升开始减缓。考虑到过高的水含量会影响甘油与水的分离,同时可能会有相对较多的脂肪酸溶解于水相中,因此我们在考察其他因素时,水/亚麻油摩尔比固定为30/1

。

+3FFA

(4)

3.2　酶用量

酶用量直接影响酶催化反应的初始速率和相同时间内的转化率。图2是33℃、n(水)/n(亚麻油)为30/1、不同脂肪酶用量条件下的实验结果。可看出,在温度及反应物摩尔比确定的前提下,随脂肪酶用量的增加,相同时间内的转化率也增加。以300min的转化率为例,酶用量占反应物总质量的3%时,转化率仅为40%;当酶质量分数增至10%时,相同时间内的转化率则高达80%。因此欲缩短反应时间,可以通过增加酶用量得以实现。但脂肪酶用量过高时其团聚现象严重,导致脂肪酶催化作用得不到最大限度的利用;另外,实际生产过程中,脂肪酶用量过高会增加生产成本。因此,无溶剂体系中酶催化亚麻油水解反应的适宜脂肪酶用量为5%左右

。

图2　脂肪酶质量分数不同时时间-转化率关系图

Fig.2　Relationshipoftime-conversionatvariouslipasequantity

3.3　温度

温度是影响油脂水解反应速率及达到平衡所需时间的重要因素。以强酸强碱为催化剂时,升高温度可以增加水和油脂的互溶度,增强反应混合物的流动性,减小传质阻力,有利于油脂水解反应进行。但对于酶催化的水解反应,还应考虑脂肪酶的最佳使用温度范围[18]的限制:温度过高,维持脂肪酶催化活性的二级构象发生变形或坍塌,导致脂肪酶活性降低或消失;当温度过低时,由于二级构象不能完全展开,因此,大量的催化活性位被包裹在酶分子内部而不能与底物接触,酶催化的高效性不能完全表现。

图3是脂肪酶的用量为反应物总质量的5%、水/亚麻油摩尔比为30/1、不同反应时间条件下的温度-转化率关系图。可以看出,在相同温度及脂肪酶用量条件下,反应时间越长,转化率越高;在同一反应时间下,在20℃～33℃内,转化率随反应温度增加而缓慢上升。说明在该区间内,脂肪酶的活性构象正在逐步开展;当温度到达最佳使用范围后,转化率快速上升,直至最大值,随后开始下降;当温度高于最佳使用范围时,转化率急剧下降,说明此时维持脂肪酶催化活性的二级构象正逐渐变形坍塌;当反应温度达45℃时,反

　　　图1　不同水/亚麻油摩尔比时的时间

-转化率关系图

　　Fig.1　Relationshipoftime-conversionatvariousmolar

ratioofwater/linseed