第五章
植物的花药和花粉培养
(一)、概念及意义
1．概念
花药培养其外植体是植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。
花粉培养的精确定义是：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养。有时花粉培养也称为小孢子培养(microspore culture)。从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。
2．单倍体植物的特点
所谓单倍体(haploid)是指具有配子体染色体数的孢子体(植物个体)。
单倍体植物有三个明显的特点：
·体细胞染色体数减半；生长发育弱，体形小、各器官明显减小；雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。
3．单倍体的应用潜力
·迅速获得纯合型材料，缩短育种年限
·获得育种中间材料
·与诱变育种相结合可以提高诱变频率
·与细胞融合相结合更具有实际应用意义
·作为遗传工程受体更为有效
·用作基础遗传研究的各个领域
(二)、花药培养
花药培养的基本程序是：
外植体选择－外植体(花蕾)预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养
(三)、花粉及小孢子培养
1．取材时期的确定
2．花粉或小孢子的分离
3．培养方法
·花药看护培养
·花粉悬浮培养
·双层培养
(四)、单倍体植株的鉴定与二倍化
1．鉴定方法：形态学鉴定染色体分析
2．单倍体植株的二倍化：继代加倍创伤法加倍
秋水仙素处理加倍
第六章植物器官和组织培养
器官培养（Organ culture ）
植物某一器官的全部或部分或器官原基的离体培养，包括根、茎、叶、花、果实、种子等。
组织培养（Tissue culture）
指形成层组织、分生组织、表皮组织、薄壁组织和各种器官组织以及愈伤组织的培养。
一、茎的培养
1、类型
茎尖培养：10-100?m的茎尖分生组织
茎段培养：带有腋(侧)芽或叶柄、长几厘米的茎节段进行离体培养（快繁） 嫩茎段常作为快速繁殖的外植体
2、作用
无性系快速繁殖；
培养无病毒苗，品种改良；
理论基础研究。
3、建立无菌材料及培养
将经过表面消毒的茎段在无菌条件下，切成几厘米长带节的节段，接种在固体培养基上。经过培养后，在茎段可直接发生不定芽，或先诱导形成愈伤组织，再脱分化形成再生苗。把再生苗进行切割，转接到生根培养基上培养，便可得到完整的小植株。
4、茎的培养发育方向
腋芽萌发
脱分化后产生胚状体
脱分化后直接产生不定器官
脱分化后形成愈伤组织
5、影响发育方向的因素
外植体大小：微形外植体或分生组织易产生愈伤组织
培养条件：温度，光照
培养基生长调节剂种类和浓度：细胞分裂素和生长素的配比。
二、根的培养
在离体根培养中，自然条件下生长在土壤中的根要解决消毒问题是非常困难的，常用无菌苗的根作为培养材料。
根的培养过程：
种子常规表面消毒，在无菌条件下在培养基上萌发。
从根尖一端切取10 mm长接种于固体培养基中。
暗条件下培养侧根发生，可以切下侧根的根尖作为新的培养材料再进行扩大培养。
三、叶的培养
很多植物的叶片具有很强的再生能力，可以作为外植体。
基本培养过程：
取叶片表面消毒平放在固体培养基上培养
大多植物的叶组织在离体培养条件下先形成愈伤组织，再分化出胚状体、茎、叶和根。
第七章植物愈伤组织培养
第一节外植体的制备
1.一般植物组织都能诱发愈伤组织。
材料必须完全无菌
外植体的大小
第二节愈伤组织的培养
一、培养基
基本培养基只有部分植物组织能够培养和维持下去，大多数组织需要添加各种各样的附加物，如维生素、氨基酸、糖醇，生长素、细胞分裂素等。
二、愈伤的培养方式：
培养分为固体和液体培养两大类。
三、培养条件
? 1、光照：愈伤组织的诱导需弱光或不需光，分化需光。继代培养一般需光。
? 2、温度：一般采用24～28℃的恒温条件进行。
? 3、湿度：较大，以免引起培养基干缩。
第三节愈伤组织形态的发生
愈伤组织培养物在某些条件下，可以再分化产生不定芽或根的分生组织甚至是胚状体，这些有结构的组织发育成苗。
一、愈伤组织形态发生的途径
1.器官的形成
在分化时，愈伤组织的表层和内部都可形成分生中心。芽多发生在愈伤组织的表层，属外起源。
根发生在组织的深处，与整体植株发生类似，是内起源。
2.体细胞胚的发生
愈伤组织体细胞胚植株
二、激素对愈伤组织分化的影响
植物生长调节物质在分化过程中的作用是极为明显的，合适的植物生长物质配比在器官分化中起着重要的作用。
器官分化的植物激素控制理论
大多数植物组织或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理论。
生长素与细胞分裂素的比例小时则产生苗，比例大时则生根，而两种激素的比例适中时，则产生无结构的愈伤组织。
第四节愈伤组织的诱导与分化
一、 外植体形成愈伤组织的时期及特点。
从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期：起动期（诱导期）、分裂期和分化期。
1. 诱导期:
诱导期是细胞准备分裂的时期，是愈伤组织形成起点。
特点：在诱导期，代谢活化了，细胞内
合成代谢迅速进行，但是细胞的大小仍然和外植体时一样，没有多大改变。
2.分裂期：
外植体中已分化的活细胞在外源激素的作用下，外层细胞出现了分裂，细胞的体积缩小，逐渐回复到分生组织状态，称为回复变化。在回复变化时，细胞通过脱分化的起动期而进入分裂，并开始形成愈伤组织。
特征：外层细胞进行分裂，而中间的细胞不分裂。另外还有细胞数目增加，体积变小；细胞核和核仁增到最大等
3.分化期
特点：分化结构的形成过程加速，超过了回复变化。外层细胞的分裂逐渐减慢，甚至停止，为次生生长所代替，大量次生结构出现。在这时期中细胞的伸展和分裂处于平衡，故细胞的平均大小往往没有变化。
二、 愈伤组织的质地
愈伤组织的质地是有明显差异的，有的坚实，有的脆。脆的与愈伤组织是悬浮培养生长的最合适的材料，容易使组织处于分散状态。
第八章植物细胞培养与次生代谢产物生产
一、单细胞的分离
由完整的植物器官分离单细胞
由培养组织中分离单细胞
二、悬浮培养
特点
1. 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养；
2. 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。
悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。
细胞生长曲线
在整个培养过程中，细胞数目不断发生变化，呈现出明显的由慢到快，再到慢，最后增长停止的细胞周期。细胞的生长呈S型曲线
细胞生长各个时期的特点：
滞后期（延迟期）：细胞很少分裂，其长短与接种量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关
对数生长期：细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变
直线生长期：细胞生长和发育最明显的时期
缓慢期：生长逐渐缓慢：培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少 静止期：生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。
三、单细胞培养
液体浅层培养法
固体平板培养法
看护培养法
微室培养法
1、液体浅层培养法
将悬浮在培养液中的细胞过滤，得到游离单细胞和小细胞团-------
培养在浅层液体培养基中
用途：主要用来增殖细胞。
特点：
有利于有毒物质的扩散；
有利于气体交换；
不利于定点观察；
单细胞生长、分裂后，难以得到单细胞系。
2、固体平板培养法
2-1 含义及用途：
? 含义：是将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。该方法是Bergmann(1960年)首创。
? 用途：是为了分离单细胞无性系，研究其生理、生化遗传上的差异而设计的一种单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。
? 2-2 特点
可以定点观察；
分离单细胞系比液体浅层培养容易；
培养细胞气体交换不畅。
3、看护培养法
3-1 看护培养的含义及用途
含义：指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。
用途：诱导形成单细胞系。
Muir(1954)首先用此法培养出烟草单细胞株。Sharp(1972)成功将此法用于番茄的花粉培养，诱导花粉形成单倍体细胞系。
3-4 特点：
? （1）效果好，易于成功。
? （2）简便易行。
? （3）不能在显微镜下直接观察细胞的生长过程。
4、微室培养法
4-1 微室培养的含义及用途
? 含义：即将细胞培养在很少量的培养基中。
? 用途：主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞团的过程。
4-2 微室培养特点：在培养过程中可以连续进行显微观察，将一个细胞的生
长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。
六、植物细胞大规模培养与次生代谢产物生产
（一）、概述
植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。
1．植物产生代谢产物的类型
植物次生产物种类繁多（据保守估计已超过2万种），如酚类化合物、醌类、生物碱、胺类、有机酸等
植物次生代谢产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。
李时珍（1593）在《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物药物，目前仍有约25％的法定药品来自植物。其药物的有效成分均为次生产物。 许多植物次生代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可以用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品。
3．规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径
·保护生态环境
·提高生产效率
·发展新型生物技术产业
第十一章植物体细胞突变体的筛选 离体培养中的遗传与变异特点 体细胞变异的细胞遗传学基础 体细胞变异的分子遗传学基础 体细胞无性系变异的诱导与选择
一、 离体培养中的遗传与变异特点
（一）、离体培养中的遗传稳定性
离体培养的细胞学基础是有丝分裂。有丝分裂的DNA半保留复制和染色体均等分裂机制，从理论上可以保证离体培养物在一般情况下的遗传稳定性。
（二）、离体培养条件下遗传变异的特点
1.普遍性：
变异可发生在各种培养类型中；
变异发生在各种植物的培养中；
变异发生与培养类型有关。
2.局限性：
从表型上看，在不同植物类型中经常发生的体细胞变异主要是植株形态（株高、叶形、叶色等）、生长势、育性、某些抗性等性状的变异。从生理生化特性上看，容易出现同功酶谱、次生代谢的消长等变异。
3.嵌合性：
嵌合性是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞，它是组织培养中常见的现象
二、体细胞变异的细胞遗传学基础
（一）、DNA核内重复复制
（二）、染色体断裂与重组
（三）、非正常有丝分裂
三、体细胞变异的分子遗传学基础
（一）、碱基突变
（二）、DNA序列的选择性扩增与丢失
（三）、转座子活化
( 四 ) 、DNA甲基化
四、体细胞无性系变异的诱导与选择
1．直接筛选法
2．间接筛选法
举例茄子抗冷细胞变异系的选育
第十二章人工种子 人工种子的概念 繁殖体类型及生产化 人工种子包被 人工种子的发展和应用前景
一、人工种子的概念及类型
1.人工种子（artificial seeds）又称合成种子（synthetic seeds）或体细胞种子（somatic seeds）。任何一种繁殖体，无论是在涂膜胶囊中包裹的、裸露的或经过干燥的，只要能够发育成完整的植株，均可称之为人工种子。
2. .人工种子根据包被的需要程度可分为三类：
·第一类是裸露的或休眠的繁殖体
·第二类为人工种皮包被的繁殖体
·第三类是水凝胶包埋再包被人工种皮的繁殖体
3.人工种子具有以下优点：
·其一，在无性繁殖植物中，有可能建立一种高效快速的繁殖方法； ·其二，可以对优异杂种种子不通过有性制种而快速获得大量种子，特别是对于那些制种困难的植物更具有重要的实用意义；
·其三，对于一些不能正常产生种子的特殊植物材料如三倍体、非整倍体、基因工程植物等，有可能通过人工种子在短期内加大繁殖应用； ·其四，与田间制种相比，可以节省制种用地，且不受季节限制，可以实现工厂化生产；
·其五，与利用试管苗相比，可以避免移栽困难，且可以实现机械化操作，同时还便于储藏和运输。
二、繁殖体的类型及其生产化
(一)、繁殖体的类型
·体细胞胚
·微芽
·微型变态器官
(二)、繁殖体的生产
1．体细胞胚的规模化生产
2．微型营养变态器官繁殖体的培养
3．芽繁殖体的培养
二、 人工种子包被
（一）、繁殖体的预处理
·体细胞胚适度脱水干燥和强制休眠；
·微型变态器官繁殖体表面消毒处理；
·芽为繁殖体的老化处理。
（二）、繁殖体的包埋
·海藻酸钠作包埋介质的操作程序是：
在配制好的海藻酸钠溶液中，按一定比例加入繁殖体并混匀，然后将其逐滴滴入2.0%～2.5%的CaCl2溶液中，经20～30 min的离子交换作用，即能形成含有繁殖体并具有一定刚性的小球珠（bead），再用水漂洗20 min以终止反应。此时的人工种子是一种胶囊状结构，将其晾干后可贮存或播种。
三、 人工种子的发展和应用前景
·1.人工种子可以贮藏，可以周年生产，避免了试管苗应用中由于季节性生产而带来的诸多矛盾。
·2.人工种子可以直接播种，减少了试管苗移栽在操作和管理上的困难，可以实现机械化操作和常规的田间管理。
·3.由于可以长距离运输，因此，人工种子可以建立相对集中的大型生产企业，实现资源和技术优化。
第十三章动物细胞培养的基本原理和方法
1 动物细胞的特点
?无细胞壁
?倍增时间长，生长缓慢
?需氧量少，对搅拌敏感
?聚集体形成
?原代细胞培养50代即开始退化
2 动物细胞培养定义
? 动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。
3 生长特性
? 贴附生长型如神经细胞
? 悬浮生长型细胞如血液白细胞，淋巴组织细胞等
4. 体外培养条件
1.温度温度过低细胞生长缓慢甚至不生长，过高导致细胞死亡。这主要是由酶和蛋白质所需的最适温度决定的。
2.pH 过酸过碱导致细胞死亡。这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构有关。
3.渗透压细胞内外可溶于水的物质比例和种类决定细胞的膨胀与收缩程度。当某一种极溶于水的物质在细胞外浓度过大时，有可能导致细胞干瘪死亡。
4.营养物和水一起，又叫细胞培养液。培养液中含有细胞增殖或生长所需各种物质。营养物质包括：N源、C源，这些物质与能量提供有关；无机盐、维生素、激素。
5.水水是细胞需要数量最大的物质。
6.无菌条件体外细胞培养仅仅是对所需的细胞进行培养，但环境(如空气)中有各种其它微生物，必须对所需细胞进行无杂菌的隔离培养。
5.动物细胞培养方式
? 一种是群体培养，将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层；
? 另一种是克隆培养，将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。
第十四章干细胞研究及其应用
1、 干细胞的概念与分类
细胞的分化过程中，细胞往往由于高度分化而完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。机体在发展适应过程中为了祢补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞，称之为干细胞（stem cell）。一旦生理需要，这些
干细胞可按照发育途径通过分裂而产生分化细胞。
干细胞有以下特点：
? （1）干细胞本身不是处于分化途径的终端。
? （2）干细胞能无限的增殖分裂。
? （3）干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。
? （4）干细胞通过两种方式生长，一种是对称分裂--形成两个相同的干细胞，另一种是非对称分裂--由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞；另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。分化细胞的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数控制。
按分化潜能的大小，干细胞可分为三种类型：
? 全能性干细胞，它具有形成完整个体的分化潜能。如胚胎干细胞，具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织、器官。 ? 多能性干细胞，这种干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制，骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞。
? 单能干细胞（也称专能、偏能干细胞），这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞。
2、 干细胞应用
随着基因工程、胚胎工程、细胞工程等各种生物技术的快速发展，按照一定的目的，在体外人工分离、培养干细胞已成为可能，利用干细胞构建各种细胞、组织、器官作为移植器官的来源，这将成为干细胞应用的主要方向。
第十五章动物细胞融合与单克隆抗体
第一节细胞融合概述
一、细胞融合的定义
细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交，是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。
二、动物细胞融合的意义
? 理论上任何细胞都有可能通过体细胞杂交而实现基因交流。
? 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。
? 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，双亲的细胞器亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。
第二节动物细胞融合的常用方法
一、仙台病毒法
仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：
①两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞膜上。并使两细胞相互凝聚；
②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要Ca2+和Mg2+，
最适PH为8.0一8.2；
②细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；
④融合成巨大细胞，仍需ATP 。
二、聚乙二醇（PEG）法
? 优点是用法简单，融合效果稳定。
? 通常用分子量低于1000的PEG作融合剂较好。
? PEG溶液在pH6.0时细胞融合率较高。
PEG的作用机理：Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。
三、电融合法
电融合法的优点：
? 融合率高、重复性强、对细胞伤害小；
? 装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程； ? 免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。
电融合的基本过程：
细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；
膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。
第三节杂种细胞的筛选
根据已经发生融合的细胞中所含有核的类型，可将其分为以下几种类型： 异核细胞：非同源细胞的融合体。
同核细胞：两个相同细胞的融合体。
多核细胞：含有双亲不同比例核物质的融合体。
常用的杂种细胞筛选方法：
? 基于药物抗性所建立的杂种筛选
? 基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选
? 基于物理特性的筛选
第四节细胞杂交瘤技术与单克隆抗体
一、单克隆抗体的概念
只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。
二、单克隆抗体的应用
? 单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可用于疾病诊断，提高疾病诊断的准确性。
? 利用单克隆抗体技术可以生产各种疫苗，这不仅能大大降低生产成本，同时也增加了疫苗的安全性。
? 单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜在技术。
? 单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不断发展。
第十六章核移植技术与动物克隆
体细胞克隆
将体细胞的细胞核移植到去掉细胞核的卵或乳腺细胞中，体细胞恢复分裂和分化能力，不经过有性生殖，这样的体细胞也能够形成一个个体，这就叫体细胞克隆。
“多莉”的诞生
“多莉”是世界上第一例用体细胞──乳腺上皮细胞，通过细胞核移植技术，在复杂的人工操作下，得到的一只小绵羊。
其操作过程是这样的：
克隆技术的应用
(1)克隆技术造福人类
A、生物学和医药研究：如在牛、羊、兔等动物奶中产药技术。
B、获得更多的优秀动物个体用于生产
C、成体细胞核移植，他可以复制生产高价药物的动物。
D、挽救濒危动物：如大熊猫
(2) 动物克隆将成为新的产业：全球成立了众多的克隆技术公司。
第十七章染色体工程
染色体工程的概念
? 染色体工程（chromosome engineering）是人们按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体，从而达到定向改变生物遗传特性和选育新品种的一种技术。
第一节 人工诱导多倍体
多倍体（polyploid）是指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体。 由于多倍体动物具有生长速度快，成活率高及抗病能力强等特点，所以人工诱导多倍体、改善动物经济性状倍受重视。
一、 人工诱导多倍体的方法
生物学方法
三倍体动物可以通过杂交产生。
? 物理学方法
? 温度休克法
? 化学方法
? 细胞松驰素B：抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而抑制细胞质分裂。 ? 秋水仙碱：抑制细胞分裂中纺缍丝的形成，因而抑制有丝分裂。
二、多倍体的鉴定方法
? 核体积测量
? 生化分析
? 染色体计数
三、多倍体动物的应用及发展趋势
? 多倍体动物的生活力及生长能力。
? 多倍体动物的性腺发育及其应用
? 多倍体动物的其它经济性状
第二节雌、雄核发育
? 雌核发育是单性生殖的一种，指卵子依靠自己的细胞核发育成个体的生殖行为。 ? 雄核发育是指因经过紫外线、X射线或γ射线处理的卵子与正常的精子受精，再在适当时间施以冷、热或高压等物理处理，使进入卵子内的精子染色体加倍，而发育为完全为父本性状的二倍体。
雌核发育的意义
? 雌核发育具有产生单性种群的能力。
? 雌核发育能迅速地产生同源型二倍体克隆。
? 广泛地用于进行基因——着丝点的定位研究。
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