生防菌Y13的定殖与诱导油茶系统抗性研究
1 生防菌Y13定殖的研究
1.1标记菌株Y13-GFP菌悬液的制备
将Y13-GFP在LB培养液中培养至对数期,离心收集菌体,生理盐水冲洗3次,用无菌水调节至菌体浓度为1×109 cfu/mL。
1.2盆栽试验设计
选用两年生健康油茶苗，移栽于花盆中，15天后将10ml的Y13-GFP菌悬液均勾地加入到植株的根围,对照以清水代替菌悬液。接种后,分别于1d、3d、5d、7d、15d、30d、60d、90d、120d、150d、180d、210d、240d、270d、300d、330d、360d取根、根际土壤、叶片进行分析。
1.3标记菌株Y13-GFP的回收与检测
根际土壤：取样时,将油茶幼苗根系的土体土壤轻轻抖落,取根际土壤,按梯度稀释计数法待菌落长出以后在荧光显微镜下计发光菌落数。
根：用无菌水小心将油茶根系的土壤全部洗掉后,用75 %的酒精消毒3 min,再用2 %的NaClO消毒10 min,最后用无菌水漂洗6次。取最后一遍漂洗的无菌水涂于LB平板上以检测消毒是否完全。在无菌条件下,将消毒过的根系用研钵磨碎后,再在摇床上振荡10 min,梯度稀释涂布平板,每个处理重复3次,30 °C培养48 h,用荧光显微镜观察计算发光菌落数,测定其定殖情况。
叶：同1.3。
1.4数据处理
2 生防菌Y13诱导油茶对炭疽病的系统抗性研究
2.1生防菌Y13对油茶炭疽病菌在油茶叶面定殖的影响
2.1.1油茶叶片组织和炭疽病菌DNA的提取
2.1.2生防菌Y13菌悬液和病原菌孢子悬液的制备
将Y13接种到液体LB培养基中,30 °C,180 rpm/min培养16小时,将菌液常温下4500 rpm离心10分钟,倒去上清液,用无菌水悬浮菌体,将菌体浓度稀释到1xlO9cfu/mL, 用无菌水稀释至1xlO9cfu/mL。
油茶炭疽菌接种到PDA固体培养基上,置于30 °C培养箱培养4-5天后取出,用无菌水将平板上的分生孢子洗脱下来,后通过4层纱布滤去菌丝及部分固体培养基,将配制好的孢子悬液通过血球计数板计算孢子数量,并用无菌水配制成浓度为1xlO6cfu/mL的孢子悬液。
2.1.3生防菌Y13的处理以及病原菌的侵染
生防菌处理一：将制备好的Y13菌悬液接种到油茶的根部(10mL/株）。
生防菌处理二：将制备好的Y13菌悬液均匀喷雾至油茶的叶面(5mL/株）。
将处理后的油茶置于温室培养7d，将制备好的病原菌孢子悬液用移液枪加到油茶叶面上,每张叶面5个侵染位点,每个侵染位点滴加10 ul的孢子悬液,将处理后的植株转移到温室,100%的湿度,28 °C的侵染温度。
2.1.4病变组织及病变周围组织的采样
病变组织一般出现在侵染后的3-4天,因此选择4dpi,6dpi, 8dpi,10dpi和12dpi (dpi=侵染后天数)这5个时间点来釆样,从同一处理的3株植株的叶片,分别取病变组织,称取约1克的病变组织提取组织DNA。
病变周围组织的取样选取3dpi,5dpi, 7dpi, 9dpi和11dpi 5个时间点来采样。由于病变组织的大小随着侵染的时间不断增大,有必要设计2个模子,大小根据病斑的情况来确定，在3dpi,
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