本科毕业论文（设计）
题 目：几种柑橘次生物质对桔小实蝇解毒酶
活性的影响
学院植物保护学院
专业 植物保护
年级 2011 级
学号
姓名 张琦
指 导 教 师 豆 威副教授
成绩 _____________________
2015年05月28日
目 录
摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 1 Abstract．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1
第1章 导论．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．2
第2章 正文 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．4
2.1 文献综述．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 4
2.1.1 桔小实蝇的分布及危害．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 4
2.1.2 柑橘次生物质简介．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．4
2.1.3 昆虫三大解毒代谢酶简介．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．5
2.2 材料与方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．6
2.2.1 供试材料．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．6
2.2.2 实验方法 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．8
2.3 结果分析 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12
2.3.1 饲喂四种次生物质后P450的活性．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． 12
2.3.2 饲喂四种次生物质后GSTs的活性．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13
2.3.3 饲喂四种次生物质后CarE的活性．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．14
第3章 结论 ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．16 参考文献．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．17 致谢．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．19
几种柑橘次生物质对桔小实蝇解毒酶活性的影响
张 琦
西南大学植物保护学院，重庆 400715
摘要：本研究以桔小实蝇Bactrocera dorsalis (Hendel)为研究对象，选取四种柑橘次生物质（香豆素、伞形酮、芸香苷和橙皮苷），运用酶标板法分别检测饲喂上述次生物质后桔小实蝇三大解毒代谢酶（细胞色素P450，谷胱甘肽-S-转移酶和羧酸酯酶）的活性。结果显示，在香豆素处理后，三种解毒酶的活性均显著升高，其中细胞色素P450活性为对照的2.87倍；伞形酮处理后，细胞色素P450和羧酸酯酶活性显著升高；橙皮苷处理后，谷胱甘肽-S-转移酶活性显著升高。由此初步推断，香豆素诱导上述解毒酶活性升高，加速对外源化合物的解毒代谢，其他次生物质对解毒酶有部分诱导效果。本研究对于研究昆虫与植物的协同进化有一定帮助。
关键词：桔小实蝇；次生物质；解毒代谢；酶活性
Effects of Several Citrus Secondary Metabolites on Detoxification Enzyme
Activities of Bactrocera dorsalis (Hendel)
Zhang Qi
College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing, 400715, P.R. China
Abstract: In this study, four citrus secondary metabolites (Coumarin, Umbelliferone, Rutin Hydrate and Hesperidin) were chosen to test their effects on the activities of detoxification enzyme (P450, CarE, GSTs) from the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis (Hendel). The results suggested that all the three detoxification enzymes activities were significantly higher after Coumarin treatment. Especially, the P450 activity was 2.87 times higher than that of control. The other secondary metabolites also had the significant effects on these enzymes. The results revealed that citrus secondary metabolites may have an interpretation
1
of the metabolic effects on B. dorsalis and they may help us to understand the co-evolution relationship between the fly and citrus secondary metabolites.
Key words: Bactrocera dorsalis (Hendel); secondary metabolites; detoxification; enzyme activity
2
第1章 导论
桔小实蝇是农业上特别是果树的重要害虫之一，分布广泛，其寄主主要为害柑橘、番石榴、杨桃等40多科250多种水果和蔬菜，是重要的检疫性害虫，近年来已经成为为害我国南方果蔬的重要害虫。我国西南地区种植的大量柑橘，是桔小实蝇的主要寄主，后者的危害每年带来巨大的经济损失。
植物次生物质是植物次级代谢的产物，主要分为含氮有机物、萜类化合物和酚类化合物三大类，如色素、生物碱、萜类、抗生素等。有关植食性昆虫与植物之间协同进化的关系研究一直是化学生态学和进化生物学的热点领域之一。在长期的进化过程中，为克服次生物质的毒害作用, 植食性昆虫发展了多种对次生物质适应的方式，其中利用解毒酶系进行解毒和排毒是其适应植物次生物质的重要方式。细胞色素P450（P450）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和羧酸酯酶（CarE）是昆虫体内重要的解毒酶系, 对有毒次生物质的代谢起重要作用, 并且解毒酶活性可被诱导增加, 但不同的昆虫这种应变反应幅度有差异。
本学位论文以桔小实蝇为研究对象，综合运用生态学、生物统计学等学科知识，在室内对其进行柑橘次生物质的饲喂处理，通过提取处理后桔小实蝇成虫体内的P450，GSTs和CarE酶液，测定不同次生物质不同浓度处理后桔小实蝇体内P450，GSTs和CarE酶的酶活，明确其体内各种解毒代谢酶活性的变化，从而进一步研究桔小实蝇和柑橘次生物质之间的关系，为进一步探究它们之间的协同进化，或者研发生物源农药奠定坚实的基础。
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第2章 正文
2.1 文献综述
2.1.1 桔小实蝇的分布及危害
桔小实蝇Bactrocera dorsalis (Hendel)，又名柑橘小实蝇、东方果实蝇、桔寡鬃实蝇、黄苍蝇、果蛆等，隶属双翅目（Diptera）、实蝇科（Trypetidae）、寡毛实蝇亚科（Dacinae）、果实蝇属（Bactrocera Macquart），是农业上的重要害虫之一[1]。桔小实蝇原产于亚热带地区，现广泛分布于东洋区和太平洋地区，美国夏威夷、澳大利亚，我国主要分布于福建、广东、广西、海南、贵州、云南、湖南、四川等地[2-3]。
该虫寄主非常广泛，可为害柑橘、木瓜、番石榴等40 多科250 多种水果和蔬菜。其成虫在瓜果较软部位处产卵，孵化后的幼虫在瓜果内蛀食果肉，造成落果或果实腐烂；而落果中的幼虫化蛹羽化后继续危害其它果实，形成循环危害，给果蔬业和花卉业造成严重的经济损失，是重要的检疫性害虫，并且有日趋严重的趋势[4]。
桔小实蝇寄主范围广泛，但易受到寄主植物果实部位、颜色、成熟度、挥发气味等因素的影响，因而对不同寄主植物的选择有明显的差异[5]。调查发现, 当柑橘、柚和柠檬等果树混杂种植或相互靠近时, 桔小实蝇雌成虫多选择在柑橘上繁殖产卵, 在柚子和柠檬上的繁殖量较少[6]。我国西南地区主要种植柑橘，桔小实蝇主要以柑橘为寄主植物，在西南地区危害很大，造成严重经济损失。研究桔小实蝇与柑橘寄主之间的关系和协同进化，有助于为该虫有效防治提供一定的指导信息。
2.1.2 柑橘次生物质简介
2.1.2.1 植物次生物质概述
除糖类、脂肪、核酸和蛋白质等基本有机物之外，植物体中还有许多其他有机物如萜类、酚类和生物碱等，这些物质与植物正常的生长发育没有直接关来, 通常认为是次级代谢的产物，因此称为植物次生物质（secondary metabolites）[7]。
植物次生物质作用繁多，有些作为生长调节物，如植物激素和生长抑制剂；有些作为引诱剂、驱避剂、拒食剂和抗生物质，在生态学上有重要意义；还有些次生物质在工业和医学上有很大的应用价值，如橡胶、人参皂苷等[8]。
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2.1.2.2 柑橘主要次生物质简介
中国是柑橘生产大国，其种植面积及产量均居世界第一。柑橘果实营养丰富，不仅含有大量的果胶、低聚糖、有机酸等营养成分，还含有多种重要的次生代谢物质，包括柠檬苦素、类柠檬苦素、生物碱、挥发油类、类黄酮等[9]。
本文选用了柑橘中常见的四种次生代谢物质，它们分别是：香豆素，伞形酮，芸香苷和橙皮苷。
柑橘中所含有的香豆素是已被科学家充分肯定的抗癌物质。研究结果表明，香豆素的抗癌功能形成途径主要有两方面：一是香豆素通过解毒酶的作用使癌物质解毒；二是与癌物质拮抗抑制其代谢的活性化。这两方面的作用主要在癌的起始阶段产生抑制效果
[10]。
柑橘果实中的伞形酮具有防治糖尿病的作用，能维持血糖平衡、改善糖尿病性综合征，从而具有防治糖尿病的功效。芸香苷和橙皮苷都是柑橘中类黄酮的一种，具有使人体维持毛细管正常抵抗力和防止动脉硬化等功能，在医药上一直作为治疗心血管系统等疾病的辅助药物和营养增补剂[11]。
2.1.2.3 次生物质对昆虫的影响
自Ehrich 和Raven [12] 提出协同进化理论以来, 植食性昆虫与植物关系的研究一直是化学生态学和进化生物学的热点领域之一。已有的研究表明, 植物次生代谢物质在植物对植食性昆虫的化学防御中起重要作用, 能引起植食性昆虫忌避、拒食、中毒, 或干扰其消化和对营养成分的吸收[13]。在长期的进化过程中，为克服次生物质的毒害作用, 植食性昆虫发展了多种对次生物质适应的方式，其中利用解毒酶系进行解毒和排毒是其适应植物次生物质的重要方式[14]。因此，研究昆虫与植物次生代谢物质之间的酶活反应有助于研究它们之间的协同进化，进一步研究出有效的生物农药。
2.1.3 昆虫三大解毒代谢酶简介
2.1.3.1 昆虫细胞色素P450的概述及功能
1958年，Klingenberg发现大鼠肝微粒体中有一种色素经连二亚硫酸钠还原后，能与CO结合，因其在450nm处有一特征吸收峰，而得名细胞色素P450，P代表pigment
[15]。
5
昆虫P450在昆虫体内执行着许多重要的功能，不仅包括蜕皮激素和保幼激素的合成与分解、各种天然产物或人工合成的外源化合物的代谢，而且在药物、杀虫剂、植物毒素等外源物的解毒中也有重要作用[16]，还参与一些起重要生理功能的内源性物质如昆虫激素、脂肪酸的代谢，在昆虫体内起着十分重要的作用[15, 17]。
2.1.3.2 昆虫GSTs的概述及功能
谷胱甘肽S-转移酶（Glutathione S-transferases，以下简称GSTs）是一类古老的超基因家族酶系，广泛分布于细菌、真菌、植物和动物等几乎所有的好氧生物体内，参与生命体众多的生理功能[18]。
GSTs具有多种功能，主要表现在以下三个方面：(1) 对异源物质的解毒代谢；(2)保护细胞免受氧化损伤；(3)参与激素的胞内运输和合成[19, 20]。针对昆虫GSTs的研究较为广泛，主要集中于杀虫剂解毒代谢与昆虫抗氧化的研究中。
2.1.3.3 昆虫CarE的概述及功能
羧酸酯酶(Carboxylesterase，CarE，EC 3.1.1.1)又称脂族酯酶，通常属于酯酶B，是一类多功能超家族酶系[21]。
研究发现羧酸酯酶超家族酶的功能高度分化，主要体现在对外源有毒物质的解毒、酯类信息素降解以及神经发育调控等过程中。羧酸酯酶在昆虫体内的功能高度分化，是昆虫体内主要的初级解毒代谢酶系之一[22, 23]。
2.2 材料和方法
2.2.1 供试材料
2.2.1.1供试昆虫
桔小实蝇于2008年采自海南省，带回实验室后各种群的幼虫用实验室研制出的含有麦胚粉、玉米粉、琼脂、酵母粉、蔗糖等在内的人工饲料进行饲养。羽化后的成虫用由酵母粉、白糖和抗坏血酸按一定比例混合而成的成虫饲料在养虫笼中饲养。幼虫和成虫均在如下条件饲养：27 ± 0.5℃、湿度75% - 80%、光暗比为14:10，且该过程保证试虫不接触任何药剂。
2.2.1.2 四种柑橘次生物质
四种柑橘次生物质：香豆素（Coumarin, CAS Number 91-64-5），伞形酮（Umbelliferone,
6
CAS Number 93-35-6），芸香苷（Rutin Hydrate, CAS Number 207671-50-9），橙皮苷（Hesperidin, CAS Number 520-26-3）均在2014年1月购置于Sigma - Aldrich, St. Louis, MO, USA公司。将四种次生物质溶于对照，对照为二甲亚砜（Dimethyl salfoxide, DMSO）和乙醇（Ethonal），在按浓度稀释到成虫人工饲料中，饲喂羽化后5日的桔小实蝇成虫，饲喂三天，进行酶活实验。 2.2.1.3 主要试剂 α-萘酚 α-Naphthol
α-乙酸萘酯(α-NA) α-Naphthyl acetate β-乙酸萘酯(β-NA) β-Naphthyl acetate 毒扁豆碱Eserine 固蓝B盐 Fast blue B salt
十二烷基硫酸钠(SDS)dodecyl sulfate
考马斯亮蓝 G-250 Coomassie brilliantblue G-250 磷酸氢二钠(Na2HPO4)Disodium hydrogen phosphate 磷酸二氢钠(NaH2PO4)Sodium dihydrogen phosphate 1-氯-2,4-二硝基苯(1-chloro-2,4-dinitrobenzene，CDNB)
牛血清白蛋白(ABS)Albumin bovine serum 还原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione，GSH) 十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS) 三羟甲基氨基甲烷(Hydroxymethyl aminomethane，Tris)
3,3’,5,5’-四甲基联苯胺
(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine,TMBZ) 细胞色素C(Cytochrome C) 醋酸钠(Sodium acetate trihydrate) 醋酸(Acetic acid)
双氧水(Hydrogen peroxide)
磷酸二氢钾(Potassium phosphate monobasic) 磷酸氢二钾(Dipotassium hydrogen phosphate) 二甲亚砜(Dimethyl salfoxide) 无水乙醇(Ethanol)
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上海化学试剂公司
国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 美国Sigma公司
国药集团化学试剂有限公司 重庆北碚化学试剂厂 上海化学试剂公司 重庆北碚化学试剂厂 重庆北碚化学试剂厂
上海试剂一厂
上海伯奥生物科技有限公司 Sigma, St. Louis, MO, USA 北京化工厂
国药集团化学试剂有限公司 Sigma, St. Louis, MO, USA Sigma, St. Louis, MO, USA 成都市科龙化工试剂厂 成都市科龙化工试剂厂 成都市科龙化工试剂厂 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 成都市科龙化工试剂厂 成都市科龙化工试剂厂
2.2.1.4 主要仪器
BIORAD680酶标仪
奥地利TECAN公司 Hitachi koki公司 上海精天电子仪器厂 成都方舟科技开发公司 温州市医疗电器厂 上海亚荣生化仪器厂
Mikro 22R高速冰冻离心机 FA1004A电子天平 pHS-4C酸度计
HKCB-3恒温磁力搅拌器
SZ-93自动双重纯水蒸馏器 2.2.1.5 样品制备
分别收集桔小实蝇海南品系羽化4日后的成虫，其中每3头成虫视为1个重复，每个样品重复3次。将四种次生物质溶于对照（对照为二甲亚砜和乙醇，两者之间无明显差异），在按浓度稀释到成虫人工饲料中，饲喂羽化后4日的桔小实蝇成虫，饲喂三天（均无明显死亡），进行酶活实验。其中每4头成虫视为1个重复，每个样品重复3次。 2.2.2 实验方法 2.2.2.1 蛋白含量测定
采用考马斯亮蓝G-250法[24]，按照表2-1加样测定，对照和待测均重复3次。待测组测得的OD值减去对照OD值的差的平均值为Y值，根据标准曲线求出X值，即为蛋白质含量 (μg)。
表2-1牛血清白蛋白标准曲线的制作
Table 2-1 The method for making standard curve of albumin bovine serum (ABS)
试剂 Reagents (μL) 100 μg /mL ABS
ddH2O 考马斯亮蓝G-250 Coomassie brilliantblue G-250
200
200
200
200
200
200
参比 Reference
0 50
1 10 40
2 20 30
处理 Treated (μL)
3 30 20
4 40 10
5 50 0
注： 25 °C条件下5 min内在595 nm下测其OD值 Absorbance was read at 595 nm at 25 °C within 5 min
8
不同发育阶段桔小实蝇酶液的制备进行三次生物重复，每次生物重复分别取实验所需不同虫态的桔小实蝇6头，加入磷酸缓冲液（PBS，0.1 mol/L，pH 7.5）2 mL于冰水浴中匀浆。匀浆液于4℃，12,600 rpm条件下离心15 min，取上清液于4℃条件下保存，用作测定桔小实蝇P450活性的酶液。
参照Bradford（1976）考马斯亮蓝G-250法[24]，在酶标板上每孔加酶液2 μL，Tris-Hcl 48μL考马斯亮蓝200 μL，对照组用0.04 mol/L pH 7.0 PBS取代酶液，在25℃条件下5 min内，在595 nm下测其OD值，重复3次。根据标准曲线求出桔小实蝇的蛋白质含量。
2.2.2.2 P450活性测定
取桔小实蝇不同次生物质不同浓度处理的样品，放入预冷后的研钵中充分研磨，随后往研钵中加入0.1 mol/L，pH 7.5的磷酸缓冲液1 mL，收集后置于12,700 g、4 °C条件下离心15 min，取上清液放于4 °C条件下保存，用作测定桔小实蝇P450s活性的酶液。
如表2-2所示，制作细胞色素C标准曲线。用不同浓度梯度的细胞色素C和TMBZ在室温下反应，2 h后在25 °C下，450 nm处读数，以细胞色素C为横坐标、OD差值为纵坐标做回归直线。
表2-2 细胞色素C标准曲线测定方法
Table 2-2 The method for making standard curve of Cytochrome C
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参照Brogdon（1997）和Tiwari（2011）方法[25, 26]，依次往酶标板加样孔中加入粗提酶液20 μL；0.625 mol/L，pH 7.2的磷酸钾缓冲液80μL；TMBZ 200 μL和体积比为3%的双氧水溶液。在25℃（室温）条件下反应2h，在450 nm下测其OD值，每个处理重复3次。
用测得的OD值减去对照OD值的平均值为Y值，代入细胞色素C标准曲线查得的X值即为反应的产物细胞色素C的含量。比活力计算公式为：
细胞色素P450比活力（equivalent units of cytochrome P450/mg of protein，EU of P450/mg pro）= 产物量／蛋白含量。
2.2.2.3 GSTs活性测定
取桔小实蝇不同次生物质不同浓度处理的样品，放入预冷后的研钵中充分研磨，随后在研钵中加入0.02 mol/L，pH 7.3的磷酸缓冲液1 mL，收集后置于17,500 g、4 °C条件下离心15 min，取上清液放于4 °C条件下保存，用作测定桔小实蝇GSTs活性的酶液。
在酶标板检测孔中依次加入以下试剂（见表2-3），每个样品重复试验三次，反应条件如表所示。用Habig法测定并计算酶活力[27]。具体计算公式如下：
GSTs活力单位（nmol/min）＝（ΔOD·υ）／（L·ε）。
其中，ΔOD为样品每分钟光吸收的变化值减去对照组光吸收的变化值的差值，“υ”表示的是酶促反应的体积，ε表示的是反应产物消光系数0.0096 L／（μmol·cm），L表示的是反应溶液的光程。
GSTs比活力（nmol/mg pro/min）＝酶活力单位／蛋白含量。
10
表2-3谷胱甘肽S-转移酶活性测定步骤 Table 2-3 Determination method of GSTs activity
试剂Reagents（μL） 0.6 mmol/L CDNB 6 mmol/L GSH
参比Reference
100 100 37℃保温20 min
酶 液Enzyme homogenate 0.5 mol/L pH 7.5 Tris-HCl
0 100
100 0
处理Treatment
100 100
注：37℃条件下，在340 nm处以30 s为间隔，记录5 min内其OD值的变化
2.2.2.4 CarE活性测定
取桔小实蝇不同次生物质不同浓度处理的样品，放入预冷后的研钵中充分研磨，再往研钵中加入0.04 mol/L，pH 7.0 磷酸缓冲液1 mL，收集浆液并置于12,000 g、4 °C条件下离心15 min，取上清液放于4 °C条件下保存。
参照表2-4在酶标板检测孔中加入试剂，对照和待测均重复3次。以α-萘酚实际含量（μmol）为横轴，以各个浓度下测出的OD值与对照组的OD值差的平均值为纵轴，完成标准曲线的制作。
表2-4 α-萘酚标准曲线测定方法
Table 2-4 The method for making standard curve of α-naphthol 试剂 Reagents（μL） 1×10-3mol/L α-萘酚 0.04 mol/L pH 7.0 显色剂 Colorant
参比 Referenc
0 175 25
1 5 170 25
2 10 165 25
3 20 155 25
处理 Treatment 4 40 135 25
5 60 115 25
6 80 95 25
7 100 75 25
8 120 55 25
注： 30℃下反应10 min，于600 nm处测定OD值
底物配制：α-NA和毒扁豆碱按1:1的比例充分混匀，现配现用。显色剂配制：5% SDS和1% 坚固蓝B盐溶液按5:2比例充分混匀，现配现用。
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参照van Aspern方法法测定羧酸酯酶活性[28]，在酶标板检测孔中依次加入试剂（见表2-5），对照和待测均重复3次。
用测得的OD值减去对照OD值的平均值为Y值，代入α-萘酚标准曲线查得的X值即为反应的产物萘酚的含量。产物量除以蛋白含量和反应时间（10min），得各样品羧酸酯酶比活力值（nmol/μg/min）。
表2-5羧酸酯酶活性测定步骤
Table 2-5 The determination procedures of CarE activity
试剂Reagents（μL）
底物Substrate
PBS
酶液 Enzyme homogenate
显色剂 Colorant 对照Control 100 75 0 30℃下反应10 min 25 25 处理Treatment 100 0 75
注：30℃下反应10 min，于600 nm处测定OD值
2.3 结果分析
2.3.1饲喂四种次生物质后P450的活性
桔小实蝇成虫饲喂四种次生物质后P450的活性见图2-1。结果显示，香豆素（0.01, 0.1 和 1mg/mL）和伞形酮（1mg/mL）处理后P450活性显著高于对照（P < 0.05），分别为对照的2.42，2.52，2.87和2.14倍，显著程度随浓度减小依次递减；芸香苷（ 0.1 和 1mg/mL）和橙皮苷（0.1 和 1mg/mL）处理后，P450活性与对照组没有明显差异（P > 0.05）。总体而言，香豆素和伞形酮处理后的桔小实蝇成虫P450s活性最高，与对照差异最为显著。
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