纳米生物复合材料相关实验中所涉及到的实验技术与概念(2)

（3）荧光光漂白及恢复技术：

利用高能量激光束将细胞内某一部分中选定靶区域的某种荧光淬灭，然后观察邻近相同的荧光标记物重新扩散入该区域的速度和方式，从而分析细胞内蛋白质运输、受体在细胞膜上的流动和大分子组装等细胞生物学过程。

（4）长时程观察细胞迁移和生长：

激光扫描共聚焦显微镜的软件一般均可自动控制地进行定时和定方式的激光扫描，而且由于新一代激光扫描共聚焦显微镜的探测效率的提高，只需要很小的激光能量就可以达到较好的图像质量，从而减小了每次扫描时激光束对细胞的损伤，因此，可以用于数小时的长时程定时扫描，记录细胞迁移和生长等细胞生物学现象。（5）其他的生物学应用：

用高能量激光束进行细胞损伤和损毁实验，一般要用紫外激光束进行细胞损毁；细胞间通讯研究；光解笼锁活化技术等。

热重分析（TGA）：热重分析（TGA），是指在程序控制温度下测量待测样品的质量与温度变化关系的一种热分析技术，用来研究材料的热稳定性和组份。

光敏剂：

在光化学反应中，有一类分子，它们只吸收光子并将能量传递给那些不能吸收光子的分子，促其发生化学反应，而本身则不参与化学反应，恢复到原先的状态，这类分子称为光敏剂。由光敏剂引发的光化学反应称为光敏反应。通常，人们把有氧分子参与的伴随生物效应的光敏反应称为光动力反应，把可引发光动力反应破坏细胞结构的药物称为光动力药物，即光敏药物。

金纳米粒子(AuNPs)的制备：

粒径为 13nm 的金纳米粒子根据之前报道的柠檬酸钠还原氯金酸的方法合成。首先，将实验所用的玻璃器皿用王水（浓 HCl/浓 HNO3，3:1）浸泡处理，然后用超纯水冲洗干净，置于烘箱中烘干后备用。将 100 mL 的质量分数为 0.01%的 HAuCl4水溶液加热至沸腾，在剧烈搅拌下迅速加入 2.0mL 质量分数为 1%的柠檬酸钠水溶液，溶液开始由淡黄色变为无色，逐渐变为酒红色，在沸腾下反应 10 分钟，接着停止加热，继续搅拌 15 分钟，溶液在室温慢慢冷却，制备得到的纳米金溶液用 0.45μm 的滤膜过滤。透射电子显微镜（TEM）照片显示金纳米粒子的大小为 13±2nm（对100个纳米颗粒采样）。制备的金纳米粒子置于冰箱 4℃保存备用。

金纳米棒的制备及表征:

制备晶种（柠檬酸钠还原氯金酸法）：5 mL浓度为 0.2 M的CTAB水溶液

与浓度为 5 mL0.5 mM的HAuCl4水溶液，在搅拌的条件下，混合均匀。向上述溶液中加入 0.6 mL 浓度为0.01M 的冰度 NaBH4溶液，得到棕黄色溶液，搅拌 2 min，室温 25 oC 保存。

制备金纳米棒（晶体生长法）：向 5 mL的浓度为 0.2 M的CTAB水溶液中，分别加入不同体积浓度为 0.004 M的 AgNO3 溶液（50 μL, 100 μL,150 μL,200 μL）。向上述溶液中再加入 5 mL HAuCl4（1 mM），温和搅拌，加入 70 μL维生素C（0.0788 M），溶液由深黄色变为无色。最后加入 12 μL 的晶种溶液，10-20 min 逐渐变色。在透射电子显微镜下观察合成的金纳米棒的形貌与尺寸。

介孔二氧化硅的合成：

介孔二氧化硅材料的合成是基于表面活性剂、在酸性或者是碱性条件下进行的。硅源可以是白炭黑、硅酸钠和正硅酸四乙脂（TEOS）。目前，应用最为广泛的介孔二氧化硅为 MCM-41 型，在低表面活性剂条件下合成。在合成过程中，少量十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)用作表面活性剂首先溶水中，加入 NaOH 调节 pH 为碱性，之后在 353K、搅拌的条件下加入正硅酸四乙脂（TEOS），混合液继续反应 2h，便生成白色介孔二氧化硅沉淀。

注意：a、有序介孔相的形成主要取决于表面活性剂和带负电的正硅酸四乙酯（TEOS）的相互作用；

b、介孔二氧化硅的形貌可以通过控制合成过程中的pH值或者是通过添加调节剂（表面活性剂、抑制剂等）的方法进行调节。

论文中上述方法的具体实验步骤：首先将 CTAB（0.5 g，1.37×10-3 mol）溶解在 240 mL 去离子水中，然后加入 1.5 mL NaOH（2 M），搅拌 10 min 后将温度调至 80 C。向上述溶液中逐滴加入 2.5 mL TEOS（1.29×10-2mol），混合物持续搅拌 2 h 即生成白色沉淀物，该白色沉淀即为 MSN。一部分白色产物用乙醇和水洗涤若干次后烘干得到洗涤的 MSN，另外一部分白色固体在 450 °

C 下煅烧 10 h，完全除去 CTAB 模板剂，得到煅烧的MSN。

方法二：在低浓度的 CTAB 作模板剂的条件下，利用氢氧化钠催化 TEOS 和不同的有机硅烷发生共缩聚反应。该方法不需要使用任何有机助溶剂或者在共缩聚的过程中不需要瞬间中和酸性溶液。通过改变加入的有机硅烷的种类和浓度得到了一系列形状不同的纳米颗粒，如球状、棒状和六边型的管。

中空介孔二氧化硅介绍其及制备：

是指中间部分是空腔，壳层是介孔二氧化硅的纳米材料，该类材料兼具了介

广泛的关注。

中空介孔二氧化硅的空腔大小和厚度可调。其制备方法主要为模板法，包括硬模板法和软模板法。

硬模板法是制备中空介孔二氧化硅中比较直接的方法，该方法可靠，有良好的可控性。一般地，这种制备方法包括四大主要步骤：①制备硬模板；②在硬模板上进行功能化修饰或者改性，使其适合进一步包覆；③在硬模板上包覆介孔二氧化硅；④除掉硬模板。步骤③是最关键的一步，因为这一步涉及介孔模板的自组装和硅烷前驱体的水解。硬模板有金属纳米颗粒、氧化物纳米颗粒和聚合物等，最常用的是单分散的二氧化硅纳米颗粒和聚苯乙烯乳球（PS）。

缺点：产率不高，有些除去模板的方法会对纳米材料的稳定性有影响。

软模板法：软模板法制备中空介孔二氧化硅与硬模板法类似，主要是选择的模板不同。用作软模板的物质主要有乳化剂液滴（油包水或者水包油）、表面活性剂和超分子胶束、聚合物和聚合物囊泡、气泡等。

注意：在制备 HMSN 的过程中，调整适当的 pH 值是比较关键的，一般控制 pH 在 9-10 范围内比较合适。如果碱性较大，会影响金纳米颗粒的稳定性，引起金纳米颗粒的聚集，不利于包覆的进行；碱性过小，不利于硅烷化试剂的充分水解，因此控制加入的氢氧化钠的量是比较重要的。在不改变其他反应条件的前提下，TEOS 的用量会对介孔二氧化硅壳层的厚度产生影响，纳米金的大小相同时，加入 TEOS 的量越大，包覆的介孔二氧化硅的厚度越大，因此通过改变 TEOS 的用量可以调整制备的 HMSN 的规格。

介孔二氧化硅的功能化修饰：

对介孔二氧化硅进行功能化修饰时根据修饰的顺序不同分为两种：一种是在制备介孔二氧化硅的过程中加入带有官能团的硅烷化试剂，硅烷前驱体和带有官能团的硅烷化试剂会同时发生水解缩合，此时得到的介孔二氧化硅在骨架和表面都有官能团存在；另一种是制备好介孔二氧化硅之后，再加入带有官能团的硅烷化试剂，此时得到的介孔二氧化硅主要是在外表面存在官能团。

氨基化的介孔二氧化硅（MS-NH2）的制备：（本论文中的方法）氨基化的介孔二氧化硅的制备参照传统的合成方法并加以少量修改。将0.25g CTAB 溶解于 100mL 二次水中，搅拌均匀，再向溶液中加入 0.875mL NaOH溶液（2M），将溶液加热至 85℃搅拌回流 30 分钟。1.25mL正硅酸四乙酯（TEOS）和 0.25mL 3-丙氨基三乙氧基硅烷（APTS）同时逐滴加入到上述溶液中，继续回流反应 2 小时，产生白色沉淀。将沉淀用甲醇离心（10000rpm）洗涤两遍之后，沉淀分散于甲醇和盐酸的混合溶液（甲醇和浓盐酸体积比为 9:160），沸腾回流 24 小时以除去介孔二氧化硅孔道内的 CTAB 模版。最后，将沉淀用甲醇离心（10000rpm）洗涤两遍，置于真空干燥箱中干燥，最终得到干燥的氨基化的介孔二氧化硅固体。

氨基修饰的介孔二氧化硅包覆的金纳米棒（AuNRs@MS-NH2）的制备:

氨基修饰的介孔二氧化硅包覆的金纳米棒的合成依据经典的共沉淀方法并加以略微的修改。将预先合成的金纳米棒溶液离心洗涤（10000rpm,×2）以除去多余的 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，为一种表面活性剂)，沉淀重新分散于 100mL二次水溶液中。取30mL上述金纳米棒溶液，向其中加入0.3mLNaOH溶液（0.1M），搅拌10分钟。然后，同时向其中加入 45μL含20% TEOS（正硅酸乙酯）的甲醇溶液以及 15μL含 2%APTE（3-氨丙基三乙氧基硅烷，是一种硅烷偶联剂）的甲醇溶液，共加入三次，间隔半小时，不停搅拌。混合液反应 24 小时形成氨基化的介孔二氧化硅壳层。将合成的 AuNRs@MS-NH2离心（10000rpm），用甲醇和水洗涤数次以去除介孔二氧化硅孔道中的 CTAB 分子，最终 AuNRs@MS-NH2沉淀分散于 6mL二次水中,溶液浓度为 0.2 mg/ mL。

制备中空介孔二氧化硅纳米颗粒（HMSN）：

HMSN 是通过将 AuNPs@MS 的纳米金核腐蚀的方法制备的。腐蚀金的方法主要有氰化法和非氰化法两大类，其基本原理都是金原子与腐蚀剂形成可溶的络合物离子。

非氰化法中最重要的是硫脲法，与氰化法相比，硫脲法提取金有无毒，浸取速度快等优点。具体的操作方法是：1 mL 硫脲试剂（1 M，pH = 2.0硫酸）与 0.5 mL 富集之后的 AuNPs@MS 混合。30 min 后，向混合溶液中入 50 μL H2O2（1 M）水溶液，5 min 内金核即被腐蚀完全。将溶液离心，弃去上清液，水洗沉淀若干次，烘干。

光漂白：

指在光的照射下荧光物质所激发出来的荧光强度随着时间推移逐步减弱乃至消失的现象。

荧光成像的质量很大程度上依赖于荧光信号强度，提高激发光强度固然可以提高信号强度，但激发光的强度不是可以无限提高的，当激发光的强度超过一定限度时，光吸收就趋于饱和，并不可逆地破坏激发态分子，这就是光漂白现象。

核壳结构纳米材料的类型：

纳米材料由于其独特的性质引起了研究者越来越多的的关注。核壳结构的组装材料类型非常多，目前主要集中在以下四个方面：

1、染料分子作为主体材料的核壳材料

有机染料分子在生物分子标记与检测中扮演着非常重要的角色，但是它本身存在着很多不足，比如抗光漂白性差，量子产率低等。因此，我们通过在外面包裹壳层来改善它在应用中的一些不足，用二氧化硅包裹有机染料形成荧光杂化的纳米颗粒就是最常见的方法。但是核壳结构的形成受很多因素的影响，比如内核材料的电性，壳材料的电性等，这些都会影响核壳结构的稳定性。此外，如果外壳材料与内核材料通过共价键或者其它化学键结合，得到的核壳纳米结构会更加稳定。